從免疫血清純化抗體

　　1.剪取一小條0.45μm的硝酸纖維膜，置于1.5mleppendorf管中，浸沒于1ml

　　1mg/ml的抗原溶液中，5min。

　　2.取出膜，置于濾紙上干燥。

　　3.將膜放置于裝有1mlBufferA的eppendorf管，輕輕震蕩混勻30min。

　　4.移去BufferA，用新鮮的BufferA洗一次，將膜浸沒于0.8-1ml相應的抗血

　　清中，1-2h,于混勻器上輕輕震蕩混勻。

　　5.移去血清，用PBS洗膜，4次，每次5min。

　　6.洗脫抗體

　　新配置100mM甘氨酸(pH2.5)抗體洗脫液，將膜置于洗液中，手輕搖

　　混勻2min，迅速將洗液轉移至裝有100μl1MTris(pH8.0)中和，使抗體

　　復性。第1次洗脫用400μl抗體洗脫液，第2，3次用200μl。

　　7.往洗脫下來的液體中加入100μlBufferA以穩(wěn)定抗體，并分裝成30μl每管，

　　于-20℃保存。

　　注：所有步驟均在室溫完成。

　　精制免疫球蛋白的方法很多。一般采用綜合技術，避免蛋白變性。如分離IgG時，多結合使

　　用鹽析法與離子交換法，以求純化。提取IgM的方法也很多，如應用凝膠過濾與制備電泳法，或離子交換與凝膠過濾等。

　　一、鹽析法

　　取xml血清加xml生理鹽水，于攪拌下逐滴加入2xml飽和硫酸銨，硫酸銨的終飽和度為50%。

　　↓4℃，3h以上，使其充分沉淀離心(3000rpm),20min,充上清，以xml生理鹽水溶解沉淀，再逐滴加飽和硫酸銨x/2ml。

　　↓置4℃3h以上，[此時，(NH4)2SO4的飽和度為33%]重復上述第二步過程1～2次。末次離心后所得沉淀物為γ-球蛋白，以0.02%mol/LpH7.4PBS溶解至xml裝入透析袋。

　　↓對PBS充分透析、換液3次，至萘氏試劑測透析外液無黃色，即無NH4 為止。

　　取透析袋內樣品少許作適當倍數(shù)稀釋后，以751型紫外分光光度計測定蛋白含量。

　　影響鹽析的因素很多，如蛋白質的濃度，鹽的濃度，飽和度和pH，溫度等都可影響鹽析的結果，操作時要充分注意(參閱本章第二節(jié))。

　　二、冷酒精沉淀法

　　分離過程如下。血清加3倍體積的蒸餾水，調節(jié)pH至7.7(±)冷卻到0℃。在激烈攪拌的條件下，加預冷的酒精(-20℃)到最終濃度為20%，保持在-5℃。產生的沉淀(A)，含有大多數(shù)種類的免疫球蛋白。沉淀A懸浮于25倍體積的0.15～20mol/LNaCl溶液(冷)中，加有0.05mol/L醋酸調節(jié)pH到5.1，產生的沉淀(B)，包括大部分的IgA和IgM，IgG留在上清液內。調節(jié)上清液的pH到7.4，加冷酒精(-20℃～-30℃)到最終濃度為25%，維持在-5℃。所得到的沉淀(C)含有90%～98%IgG。不同動物，IgG分離的條件和產量略有不同。見表2-5。從沉淀(B)可按下述方法進一步分離出IgA和IgM的混合物：將沉淀(B)懸浮在0℃水中，調節(jié)pH到5.1，離心去除不溶的蛋白。調節(jié)上清液離子強度到0.01～0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到最終濃度為10%，保持在–2℃或-3℃低溫，所得的沉淀(B-B)主要含IgA和IgM。

　　表2-5從幾種動物和人血清沉淀A分離IgM的條件

　　物種pH沉淀條件IgG產量

　　酒精濃度(%)離子強度

　　人5.115.0.0165

　　山羊5.200.0165

　　家兔5.2100.0170

　　大鼠5.0150.0150

　　豚鼠5.1150.0170

　　三、DEAE-SephadexA-50柱層析純化免疫球蛋白

　　原理：DEAE-SephadexA-50(二乙氨基—乙基-葡萄糖凝膠A-50)為弱堿性陽離子交換劑。用NaOH將Cl-型轉變?yōu)镺H-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白屬于中性蛋白(等電點為pH6.85～7.5)，其余均屬酸性蛋白。PH7.2～7.4的環(huán)境中，酸性蛋白均被DEAE-SephadexA-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通過柱層析，γ球蛋白便可在洗脫中先流出，而其他蛋白則被吸附在柱上，從而便可分離獲得純化的IgG.

　　(一)操作步驟

　　1.DEAE-Sephadex

　　A-50預處理稱DEAE-SephadexA-50(下稱A-50)5g，懸于500ml蒸餾水內，1h后傾去上層細粒。按每克A-50加0.5mol/LNaOH15ml的比例，將A-50浸泡于0.5mol/LNaOH液中，攪勻，靜置30min，裝入布氏漏斗(墊有2層濾紙)中抽濾，并反復用蒸餾水抽洗至pH呈中性;再以0.5mol/LHCl同上操作過程處理，最后以0.5mol/LNaOH再處理一次。處理完后，將A-50浸泡于0.1mol/LpH7.4PB中過夜。

　　2.裝柱

　　(1)將層析柱垂直固定于滴定架上，柱底墊一圓形尼龍紗，出水口接一乳膠或塑料管并關閉開關。

　　(2)將0.1mol/L,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入經(jīng)預處理并以同上緩沖液調成稀糊狀的A-50。等A-50。等A-50凝膠沉降2～3cm高時，開啟出水口螺旋夾，控制流速1ml/min，同時連續(xù)倒入糊狀A-50凝膠至所需高度。

　　(3)關閉出水口，待A-50凝膠完全沉降后，柱面放一圓形濾紙片，以橡皮塞塞緊柱上口。通過插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與洗脫液瓶相連接。

　　3.平衡

　　啟開出水口螺旋夾，控制流速12～14滴/min。使約2倍床體積的洗脫液流出。并以pH計與電導儀分別測定洗脫液及流出液之pH值與離子強度，兩者達到一致時關閉出水口，停止平衡。

　　4.加樣及洗脫

　　啟開上口橡皮塞入下口螺旋夾，使柱中液體緩慢滴出，當柱面液體與柱面相切時，立即關閉出水口，以毛細滴管沿柱壁加入樣品(體積應<床體積2%，蛋白濃度以<100mg為宜)。松開出水口螺旋夾使面樣品緩慢進入柱內，至與柱面相切時，立即關閉下口，以少量洗脫液洗柱壁2～3次;再放開出水口，使洗液進入床柱，隨后立即于柱面上加入數(shù)毫升洗脫液，緊塞柱上口，使整個洗脫過程成一密閉系統(tǒng)。并控制流速12～14滴/min。

　　5.收集

　　開始洗脫的同時就以試管進行收集。每管收集3～5ml。共收集10～15管。

　　6.測蛋白

　　以751型紫外分光光度計分別測定每管OD280nm,與OD260nm,按公式計算各管蛋白含量。并以OD280nm為縱座標，以試管編號為橫座標，繪制洗脫曲線。

　　7.合并、濃縮

　　將洗銳峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進行合并，以PEG(MW6000)濃縮至所需體積，加入0.02%NaN3防腐，于4℃保存?zhèn)溆谩ｉL期保存時應貯于-40℃冰箱。

　　8.A-50凝膠的再生

　　在柱上先以2mol/LNaCl洗脫蛋白至流出液的OD280nm<0.02，再以蒸餾水洗去柱中鹽。然后按預處理過程將A-50再處理一遍即達到再生。近期用時泡于洗脫緩沖液中4℃保存;近期不用時，以無水酒精洗2次，再置50℃溫箱烘干，裝瓶內保存。

　　(二)注意事項

　　(1)柱的選擇：從理論上說，只要柱足夠長，就能獲得理想的分辨率，但由于層析柱流速同壓力梯度有關，柱長增加使流速減慢，峰變寬，分辨率降低。柱的直徑增加，使流體流動的不均勻性增加，分辨率明顯下降。

　　(2)純化過程必須嚴格控制緩沖液的pH及離子強度。樣品與A-50凝膠必須用洗脫緩沖液徹底平衡后，才能進行柱層析。

　　(3)所裝的柱床必須表面平整，無溝流及氣泡，否則應重裝。

　　(4)洗脫過程中應嚴格控制流速，切勿過快。

　　(5)上樣的體積要小，濃度不宜過高。

　　(6)加樣及整個洗脫過程中，嚴防柱面變干。

　　四、SPA-SepharoseCL-4B親合層析純化

　　IgG及IgG亞類

　　(一)原理

　　葡萄球菌A蛋白(SPA)具有與多種哺乳動物IgG分子Fc段結合的能力，并與不同IgG亞類的結合力有所差別。改變pH及離子強度可洗脫結合于SPA-SepharoseCL-4B柱上的IgG或不同的IgG亞類，可直接純化血清或小鼠腹水中的IgG抗體。

　　(二)操作步驟

　　用0.1mol/LpH8.0磷酸緩沖液浸泡SPA-SepharoseCL-4B凝膠，15min。按1g干膠200ml上述緩沖液充分洗滌凝膠，(用玻璃漏斗過濾或置燒杯中洗滌)。

　　↓

　　裝柱后用0.1mol/LpH8.0磷酸緩沖液平衡。標本可用硫酸銨粗提物，先10000g離心除去雜質，必要時用0.22μm濾膜過濾，上樣前用1mol/LpH9.0Tris液調整標本液pH至8.1或對平衡液透析過夜。

　　↓

　　加樣，一般按25～30mgIgG/g濕膠比例加樣，室溫作用15min，用0.1mol/LpH8.0磷酸緩沖液充分淋洗，到淋洗液OD值為<0.02。

　　↓

　　用不同pH的枸櫞酸洗脫液洗脫，流速20ml/h。如純化小鼠IgG1一般用pH6.0;純IgG2a用pH4.0;純化IgG2b用0.1mol/LpH3.0醋酸鹽緩沖液0.1mol/LpH3.0glycine-HCl緩沖液洗脫。

　　↓

　　用pH3.0或4.0洗脫液洗脫時，用適量固體Tris直接中和含有IgG的洗脫液。

　　↓

　　收集洗脫液測OD值，根據(jù)實驗需要透析除鹽后進行濃度、純度和活性測定。

　　(三)試劑器材

　　(1)SPA-SepharoseL-4B(pharmacia)

　　(2)磷酸緩沖液0.1mol/LpH8.0 0.02%NaN3

　　(3)枸櫞酸緩沖液0.1mol/LpH6.00.1mol/LpH4.0 0.02%NaN30.1mol/LpH3.0

　　(4)1mol/LpH9.0Tris溶液

　　(5)再生緩沖液：①0.1mol/LTris含0.5mol/LNaCl調整pH至8.5 0.02%NaN3;②0.1mol/L醋酸鈉含0.5mol/LNaCl調整pH至4.5 0.02%NaN3。

　　(四)注意事項

　　(1)SPA-SepharoseCL-4B凝膠價格昂貴，可再生后反復使用10～20次左右。方法：先用10倍柱體積0.1mol/LpH8.5Tris含0.5mol/LNaCl溶液洗脫柱上的殘存雜蛋白;再用10倍柱體積0.1mol/LpH4.5醋酸鈉緩沖液含0.5mol/LNaCl溶液洗脫柱上的殘存雜蛋白;0.1mol/LpH8.0磷酸緩沖液平衡，4℃貯存。

　　(2)SPA-SepharoseCL-4B親合層析法還可用于：①除去抗體液中IgG,檢測非IgG抗體(如IgM)的生物學活性;②除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段;③吸收或純化免疫復合物。

　　(3)狗、貓的多克隆IgM和IgA以及單克隆IgA和IgM也具有與SPA結合的能力。

　　五、高效和液相色譜純化小鼠腹水中單克隆抗體

　　從小鼠腹水中純化McAb的方法有鹽析、離子交換層析、凝膠過濾和親合層析等。應用TSKDEAE-SPW離子交換層析柱從小鼠腹水中純化McAb不僅純化速度快，回收率和得率高，而且保持良好的生物學活性。

　　(一)原理

　　根據(jù)離子交換原理，將經(jīng)硫酸銨粗提的含McAbγ球蛋白上樣結合于層析柱上，通過增加洗

　　脫液中的離子強度，洗脫并收集蛋白峰。

　　(二)操作步驟

　　腹水離心10000g,10min，除去細胞和雜質，在4℃下逐滴加入飽和硫酸銨溶液，使終濃度為40%飽和硫酸銨

　　↓攪拌20～30min

　　離心，沉淀用40%飽和硫酸銨洗滌2次后溶于PBS，對緩沖液A(pH8.5,

　　20mmol/LTris緩沖液)透析除鹽

　　↓4℃過夜

　　用帶有1000μl樣品環(huán)的高壓加樣活門將透析后粗提物加樣于經(jīng)緩沖液A液平衡的TSK

　　DEAESPW離子交換層析柱

　　↓

　　洗脫流速1ml/min

　　0～1min：0→5%緩沖液B(20nmol/L

　　Tris,Ph8.5,含2.0

　　mol/L醋酸鈉)

　　1～2min(線性梯度洗脫)：5→20%緩沖液B

　　20～22min：20→0%緩沖液B

　　↓

　　洗脫液用紫外280nm進行監(jiān)測

　　↓

　　收集蛋白峰，進行含量、純度和活性測定

　　(三)試劑和器材

　　(1)TSK

　　DEAESPW離子交換層析柱(75mm×7.5mm,Bio

　　Rad)

　　(2)高效液相色譜儀(包括控制系統(tǒng)、溶劑傳遞系統(tǒng)、高壓加壓活門和紫外280nm監(jiān)測系統(tǒng))

　　(3)PBS，緩沖液A和B。

　　(四)注意事項

　　(1)所用緩沖液和加樣粗提物均需0.2μm濾膜過濾。

　　(2)在本實驗條件下，IgG1峰一般在線性梯度洗脫開始11-12min。但不同類和亞類抗體以及不同特異性McAb

　　的存留時間(retention

　　time)有所差異。

　　【附錄】

　　制備單克隆抗體常用的試劑

　　1.RPMT-1640培養(yǎng)液其中含2mmol/L谷氨酰胺，25

　　mmol/LHepes,5×10-5mol/L

　　RPMT-1640完全培養(yǎng)液上述溶液加10%～20%滅活小牛血清

　　3.HT母液×100

　　次黃嘌呤(H)

　　1.0×10-2mol/L

　　136.1mg

　　胸腺嘧淀核苷(T)1.6×10-3mol/L38.8mg

　　蒸餾水100ml

　　4.A母液×100

　　氨基喋呤(A)4×10-3mol/L

　　1.76mg

　　蒸餾水90.0ml

　　1mol/LNaOH0.5ml

　　溶解后,加1mol/L

　　HCl0.5ml,再補加蒸餾水至100ml。

　　5.HAT選擇培養(yǎng)液

　　RPMI-1640培養(yǎng)液

　　80ml

　　滅活小牛血清20ml

　　HT母液×100

　　1ml

　　A母液×100

　　1ml

　　用5%NaOH調節(jié)pH至7.4左右。

　　6.HT培養(yǎng)液

　　RPMI-1640培養(yǎng)液

　　80ml

　　滅活小牛血清

　　20ml

　　HT母×100

　　1ml

　　用5%NaOH調節(jié)pH至7.4左右。