食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)

　　大 腸 菌 群測(cè)定

　　范圍

　　本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸菌群的側(cè)定方法。

　　本標(biāo)準(zhǔn)適用于各類(lèi)食品中大腸菌群的測(cè)定。

　　2 規(guī)范性引用文件

　　下 列 文 件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有

　　的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究

　　是否可使用這些文件的最新版本‘凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)，

　　GB /T 4 789.2 8-2003 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)染色法、培養(yǎng)基和試劑

　　術(shù)語(yǔ)和定義

　　下 列 術(shù) 語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

　　3. 1

　　大腸 菌 群 Colijormb acteria

　　一 群 能 發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。該菌主要來(lái)源于人畜糞

　　便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。

　　食 品 中 大腸菌群數(shù)系以100m L(g)檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)(MPN)表示。

　　4 設(shè)備和材料

　　冰箱:OC-4C。

　　恒溫培養(yǎng)箱:36℃士1C ,

　　恒溫水浴鍋:46℃士1C。

　　顯微鏡:lox一loo x。

　　均質(zhì)器或滅菌乳缽。

　　架盤(pán)藥物天平:0g -500g >精確至0.5 g ,

　　滅菌吸管1m l,(具0.0 1m L刻度),10m l,(具0.1 m l,刻度)。

　　滅菌錐形瓶:500 mL,

　　滅菌玻璃珠:直徑約5 mm,

　　滅菌培養(yǎng)皿:直徑90 mm,

　　滅 菌試管:16m mX 160m m,

　　滅菌刀、剪子、鑷子等。

　　5 培養(yǎng)簽和試荊

　　5.1 乳搪膽鹽發(fā)酵管:按GB/T 4789. 28-2003中4.9規(guī)定。

　　5.2 伊紅美藍(lán)瓊脂平板:按GB/T 4789. 28-2003中4.25規(guī)定。

　　5.3 乳搪發(fā)酵管:按GB/T 4789. 28-2003中4.10規(guī)定。

　　GB/T 4789. 3-2003

　　5.4 EC肉湯:按GB/T 4789.2 8-2003中4.11規(guī)定。

　　5.5 磷酸鹽緩沖液:按GB/T 4789. 28-2003中3.22規(guī)定。

　　5.6 0.85%滅菌生理鹽水。

　　5.7 革蘭氏染色液:按GB/T 4789. 28-2003中2.2規(guī)定。

　　6 檢驗(yàn)程序

　　大腸菌群檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖1,

　　7 操作步馭

　　7.1 檢樣稀釋

　　7.1.1 以無(wú)菌操作將檢樣25 g(mL)放于含有225 mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)

　　(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1，10的均勻稀釋液。固體檢樣

　　最好用均質(zhì)器，以8 000 r/min-10 000 r/min的速度處理1 min，做成1，10的均勻稀釋液。

　　7.1.2 用1 mL滅菌吸管吸取1，10稀釋液1 mL，注人含有9 mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管

　　內(nèi)，振搖試管混勻，做成1，100的稀釋液。

　　7.1.3 另取1 mL滅菌吸管，按上條操作依次做10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1 mL滅

　　菌吸管。

　　7.1.4 根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)�檢樣污染情況的估計(jì)，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度，接種三管。

　　7.2 乳箱發(fā)酵試驗(yàn)

　　將 待 檢 樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1m L以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，1m L及

　　1 mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種三管，置36℃ 士11C溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24 h士2h，如

　　所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。

　　7.3 分離培養(yǎng)

　　將 產(chǎn) 氣 的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36℃士10C溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18h --24h ，然后取

　　出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。

　　7.4 證實(shí)試驗(yàn)

　　在 上 述 平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1個(gè)一2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置

　　36℃士1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h士2h，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無(wú)芽胞桿菌，

　　即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。

　　7.5 報(bào)告

　　根 據(jù) 證 實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每l00mL(g)大腸菌群的MPN值。

　　8 糞大腸菌群(Faecal coliform)

　　8.1 用接種環(huán)將所有產(chǎn)氣的乳糖膽鹽發(fā)酵管培養(yǎng)物(見(jiàn)7.2)轉(zhuǎn)種于EC肉湯管內(nèi)，置44.5℃士0.2 0C

　　水浴箱內(nèi)(水浴箱內(nèi)的水面應(yīng)高于EC肉湯液面)，培養(yǎng)24 h士2h，經(jīng)培養(yǎng)后，如所有EC肉湯管均不產(chǎn)

　　氣，則可報(bào)告為陰性;如有產(chǎn)氣者，則將所有產(chǎn)氣的EC肉湯管分別轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置培養(yǎng)

　　18 h-24 h，凡平板上有典型菌落者，則證實(shí)為糞大腸菌群陽(yáng)性。

　　8.2 結(jié)果報(bào)告

　　根 據(jù) 證 實(shí)為糞大腸菌群的陽(yáng)性管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每100m L(g)糞大腸菌群的MPN值(見(jiàn)

　　表1),