細胞培養(yǎng)中的污染分為兩類，化學污染和生物污染。

　　化學污染

　　化學污染是一些對細胞有毒性的或?qū)�細胞產(chǎn)生刺激的化學物質(zhì)。這些污染一般來自于沒有洗凈的器皿、不純的化學試劑和質(zhì)量較差的蒸餾水等。

　　化學污染中比較引人注意的是細菌內(nèi)毒素。它是革蘭氏陰性細菌細胞死亡后解體釋放出的疏水性的細胞壁組成物質(zhì)，對塑料等疏水性強的物質(zhì)有很強的吸附能力。細菌內(nèi)毒素可刺激部分細胞產(chǎn)生一些激素或細胞因子，對細胞生長和實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。細菌內(nèi)毒素是臨床上的最主要的熱原(即注射到動物體內(nèi)會導致動物發(fā)熱)，所以通過細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的疫苗、細胞因子等用在臨床上的藥品的生產(chǎn)過程中更是要避免細菌內(nèi)毒素的污染。

　　生物污染

　　生物污染包括比較容易發(fā)現(xiàn)的細菌、霉菌和酵母的污染，和較難發(fā)現(xiàn)的病毒、支原體和其他細胞的污染。

　　細菌、霉菌和酵母到處存在，它們能在合適的環(huán)境中非常快速的生長。這些污染比較容易觀察到，它們往往會使其污染的培養(yǎng)液產(chǎn)生可見的變化，或者通過顯微鏡觀察就可以看見。

　　· 由于病毒有種屬特異性，所以病毒污染的概率比較小。但是病毒污染難于發(fā)現(xiàn)，因為病毒顆粒特別微小，一般的實驗室都沒能力檢查細胞培養(yǎng)中污染的病毒。由于病毒一般潛伏在細胞內(nèi)，對整個細胞培養(yǎng)不是致死的，所以它可能會使研究人員長期得到受病毒影響的細胞的實驗結(jié)果。

　　1956 年 Robinson 及其同事首次發(fā)現(xiàn)細胞培養(yǎng)中的支原體污染。90年代初美國的一個調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在該國的細胞培養(yǎng)中，至少有15%被支原體污染。由于支原體沒有細胞壁，在細胞培養(yǎng)液中幾乎是透明的，同時對常用于細胞培養(yǎng)中的抗生素不敏感，不引起 pH 變化，不使培養(yǎng)液渾濁，所以支原體污染不容易被發(fā)現(xiàn)，但是其存在會影響實驗的結(jié)果。

　　細胞的交叉污染在細胞培養(yǎng)中發(fā)生的嚴重程度大大超過人們的想象：1981 年對ATCC細胞株的調(diào)查顯示：超過 60 標記為其他細胞株的細胞居然是 HeLa 細胞。

　　怎么樣才能減少污染的機會?

　　減少化學污染

　　對于自己用粉末配制培養(yǎng)液的實驗室來說，配制培養(yǎng)液要使用重蒸餾水，以減少帶入化學污染的機會。如果要添加NaHCO3，要選用純度高的NaHCO3，最好是經(jīng)過細胞培養(yǎng)測試的。

　　· 由于病毒有種屬特異性，所以病毒污染的概率比較小。但是病毒污染難于發(fā)現(xiàn)，因為病毒顆粒特別微小，一般的實驗室都沒能力檢查細胞培養(yǎng)中污染的病毒。由于病毒一般潛伏在細胞內(nèi)，對整個細胞培養(yǎng)不是致死的，所以它可能會使研究人員長期得到受病毒影響的細胞的實驗結(jié)果。

　　1956 年 Robinson 及其同事首次發(fā)現(xiàn)細胞培養(yǎng)中的支原體污染。90年代初美國的一個調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在該國的細胞培養(yǎng)中，至少有15%被支原體污染。由于支原體沒有細胞壁，在細胞培養(yǎng)液中幾乎是透明的，同時對常用于細胞培養(yǎng)中的抗生素不敏感，不引起 pH 變化，不使培養(yǎng)液渾濁，所以支原體污染不容易被發(fā)現(xiàn)，但是其存在會影響實驗的結(jié)果。

　　細胞的交叉污染在細胞培養(yǎng)中發(fā)生的嚴重程度大大超過人們的想象：1981 年對ATCC細胞株的調(diào)查顯示：超過 60 標記為其他細胞株的細胞居然是 HeLa 細胞。

　　怎么樣才能減少污染的機會?

　　減少化學污染

　　對于自己用粉末配制培養(yǎng)液的實驗室來說，配制培養(yǎng)液要使用重蒸餾水，以減少帶入化學污染的機會。如果要添加NaHCO3，要選用純度高的NaHCO3，最好是經(jīng)過細胞培養(yǎng)測試的。

　　· 另外盡量使用一次性的細胞培養(yǎng)器皿。由于標準廠家一次性細胞培養(yǎng)器皿的生產(chǎn)環(huán)境比較嚴格，得到的產(chǎn)品潔凈度很高，從而減少了由細胞培養(yǎng)器皿帶入污染的機會。

　　減少生物污染

　　由于一般的污染發(fā)生在細胞培養(yǎng)的操作過程中，所以良好的細胞培養(yǎng)操作環(huán)境和操作習慣是減少生物污染的關鍵。

　　要用一個專門的房間用于細胞培養(yǎng)，注意保持房間的清潔。

　　要有一個定期檢驗的合格的超凈臺(超凈臺內(nèi)的潔凈度應該為100級，與計算機硬盤的生產(chǎn)環(huán)境相當)。在使用超凈臺前開啟通風裝置并打開紫外燈滅菌30分鐘。操作時要戴一次性橡膠手套，并噴灑70%酒精消毒。任何帶入超凈臺的非無菌物件都要噴灑70%酒精消毒。收集廢培養(yǎng)液的瓶子要加入漂 白液，以避免微生物的生長。每次實驗完后，要向通向廢培養(yǎng)液瓶的塑料管內(nèi)噴灑70%酒精，并且用蒸餾水和70%酒精先后擦拭臺面(只用70%酒精擦拭會導致灑落在臺面的培養(yǎng)液在臺面上形成難以清除的污垢)。

　　不要在超凈臺里使用酒精燈等燈具，因為這樣會因燈的熱的火焰引起的空氣對流而破壞超凈臺里本來規(guī)則的空氣層流，使本來存在于超凈臺底層的微粒被帶到上層，帶來更多的污染機會。

　　·加熱培養(yǎng)液的37°C恒溫水浴中非常容易有微生物的生長，從而成為一個重要的污染源。所以需要定期清洗恒溫水浴。細胞培養(yǎng)箱內(nèi)的用于保持濕度的水盤也需要定期清洗。為了減少不同細胞株間的相互污染，不要用同一瓶培養(yǎng)液或胰酶培養(yǎng)不同的細胞;不要在一個超凈臺上同時進行多種細胞的操作�！　》盅b每次小量使用的溶液(如胰酶、抗生素、谷氨酸溶液)，以減少多次使用時污染的機會。

　　以防萬一

　　即使再小心，污染難免還是會發(fā)生。所以得到一個新的細胞株后的第一件事情，是把細胞生長擴增后凍存起來，以備不測。

　　內(nèi)毒素是什么?

　　內(nèi)毒素的化學成分是脂多糖，是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要組分之一。一個活的細菌很少釋放內(nèi)毒素，但死后可放出大量內(nèi)毒素。

　　內(nèi)毒素在血液中存在時會引起動物發(fā)熱，是醫(yī)療注射液中最主要的。19 世紀 40 年代開始用注射溶液引起兔的發(fā)熱反應實驗來檢測熱原(主要是細菌內(nèi)毒素)。后來研究者發(fā)現(xiàn)鱟(一種海洋生物)血液遇到極微量的內(nèi)毒素會發(fā)生凝血反應，從而在19 世紀 70 年代發(fā)明了鱟試劑用于快速精確檢測內(nèi)毒素。內(nèi)毒素含量一般用國際單位( EU )來衡量，一般來說 1EU 大致等于 0.1-0.2ng。

　　由于內(nèi)毒素會對很多種細胞產(chǎn)生刺激，影響實驗結(jié)果，所以在實驗中要盡量減少在培養(yǎng)液中的內(nèi)毒素的來源。

　　由于生產(chǎn)工藝的提高，來自標準廠家的血清和培養(yǎng)液中的內(nèi)毒素含量很少。所以現(xiàn)代實驗室細胞培養(yǎng)中內(nèi)毒素的來源主要是水、添加劑、細胞培養(yǎng)器皿等。　　傳統(tǒng)的玻璃儀器制備的雙蒸水和通過離子交換柱、活性炭柱和超濾三個環(huán)節(jié)的純水制備儀制備的超純水都能滿足細胞培養(yǎng)用水的要求。盛水器具上的細菌內(nèi)毒素可能給超純水帶來污染。長時間放置的超純水也可因盛水器具上細菌生長而污染細菌內(nèi)毒素。

　　內(nèi)毒素能緊密的粘在玻璃器皿上，實驗室里用普通的方法不能完全的消除除內(nèi)毒素。用 250 ℃， 30 分鐘或 180 ℃， 2 小時干熱滅菌能完全除掉玻璃器皿上的內(nèi)毒素。

　　一次性塑料器皿經(jīng)過高溫注塑成型，沒有內(nèi)毒素存在。但在處理、包裝等生產(chǎn)過程中，可能污染內(nèi)毒素。

　　應該選用什么樣的抗生素和相應的濃度?

　　抗生素在五十年代開始細胞培養(yǎng)中得到使用。它大大減少了細胞培養(yǎng)中細菌等微生物污染的機會，從而使細胞培養(yǎng)在普通實驗室就可以輕易操作。

　　·最常用的抗生素是芐基青霉素鉀鹽 (Penicillin G potassium )和鏈霉素硫酸鹽 ( Streptomycin sulphate)的混合液，通稱PS。青霉素抑制細菌細胞壁的合成，鏈霉素則抑制細菌蛋白質(zhì)的合成。一般青霉素的濃度為10,000U/ml, 鏈霉素的濃度為10,000ug/ml。青霉素在普通的醫(yī)院或藥店可以買到。鏈霉素由于對聽覺神經(jīng)具有損害，已經(jīng)很少用于醫(yī)療，所以需要向?qū)ｉT的化學試劑公司購買。

　　有一些培養(yǎng)過程污染源比較多，比如組織培養(yǎng)。為了減少污染，常常需要在培養(yǎng)液中加入其他的抗生素。比如慶大霉素(Gentamycin sulfate，抑制細菌蛋白質(zhì)的合成)， 兩性霉素B (amphotericin B，干擾含膽固醇的細胞膜的功能，抑制酵母和真菌的生長，對培養(yǎng)細胞也具有一定的毒性)等。

　　可用于細胞培養(yǎng)的抗生素種類非常多，如果細胞培養(yǎng)過程比較特殊，污染源比較多，可以考慮選用其他的抗生素。

　　即使使用多種抗生素的組合，污染還是有可能發(fā)生。所以減少污染的關鍵，是規(guī)范的實驗環(huán)境和操作�？股�素的使用，也會使一些污染長期潛伏，同時與五十年代抗生素開始引入細胞培養(yǎng)時相比，現(xiàn)在的過濾技術，超凈臺的質(zhì)量等都已經(jīng)有了很大的提高，在培養(yǎng)過程中帶入污染的機會大大減小了，所以有不少人建議在普通的細胞培養(yǎng)過程中不要使用抗生素。

　　為什么有人提倡細胞培養(yǎng)液中不要加抗生素?

　　抗生素雖然減少了可以觀察到的細菌、酵母等微生物的污染機會，卻會增加支原體、病毒等隱性污染的機會。

　　因為細胞培養(yǎng)中污染主要來源于空氣中的微粒和汽霧，而這些微粒和汽霧可以同時攜帶支原體、病毒和其他微生物。當抗生素使用時，可見污染被抑制而隱性污染又沒被注意到，這樣支原體、病毒等隱性污染的機會反而增加了。Barile的一項研究顯示(1)，72%持續(xù)使用抗生素培養(yǎng)的細胞有支原體污染，而不使用抗生素培養(yǎng)的細胞支原體污染的比例只有7%。

　　反過來如果不使用抗生素，支原體、病毒的污染往往會伴隨細菌和酵母等的污染。由于細菌和酵母等的污染很容易觀察到，污染細胞的及時清理就大大減少了支原體、病毒的污染機會。

　　潛在的支原體、病毒的污染會帶來很大的危害。這些微生物的存在會影響細胞的理化性質(zhì)，從而使研究者得到錯誤的實驗結(jié)果。在嚴重的情況下，甚至使一個實驗室數(shù)年的研究白白浪費。

　　由于過濾技術的提高和超凈臺質(zhì)量的改進，在規(guī)范的細胞培養(yǎng)操作過程中引進污染的機會已經(jīng)被大大降低了。所以比較合理的建議是，在常規(guī)的細胞培養(yǎng)中不要使用抗生素。只有在培養(yǎng)污染源很多(比如組織培養(yǎng))，或者培養(yǎng)非常珍貴的細胞株時才使用抗生素。

　　1. Barile, M. F. Mycoplasmal Contamination of Cell Cultures: mycoplasma-Virus-Cell Culture Interactions. in Contamination in Tissue Culture, J. Fogh, ed. (Academic Press, Inc., New York, 1973) 131-171. 38. Perlman, D. Use of Antibiotics in Cell

　　直接培養(yǎng)法檢測細胞培養(yǎng)中的支原體污染

　　特點: 最直接最靈敏的檢測手段。

　　缺點： 培養(yǎng)時間長，需3-5周才能判斷。有些支原體不能在培養(yǎng)基上培養(yǎng)出來(例如M. hyorhinis)。需要同時培養(yǎng)支原體菌株作陽性對照，可能會造成污染。

　　材料： 葡萄糖、L-鹽酸精氨酸、Difco PPLO broth(Difco 0554-17-1)、馬血清、15%酵母膏溶液(高壓滅菌)、Bacto agar、無菌有蓋螺旋試管(高壓滅菌)、無菌培養(yǎng)皿(60x15mm)、玻璃棒、37℃培養(yǎng)箱、厭氧缸(厭氧缸長期培養(yǎng)易有污染，所以厭氧包應該用無菌水，每次打開厭氧缸后用70%酒精擦拭內(nèi)壁。)

　　培養(yǎng)基準備： 基本配方為Difco PPLO broth(60%)，馬血清(20%)，15%酵母膏溶液(10%)，10x儲存液(10%)。由于培養(yǎng)時間長，可加50u/ml青霉素至10x儲存液或加入乙酸鉈(1：2000)至培養(yǎng)基中以防止其他細菌的污染。

　　10x儲存液(1升)： 稱取50克葡萄糖，10克L-鹽酸精氨酸溶于1升蒸餾水中。用0.22μm無菌過濾膜過濾除菌，分裝100ml至瓶中，-70℃保存。

　　液體培養(yǎng)基(1升)： 稱取21克Difco PPLO broth，0.02克酚紅于600ml蒸餾水中加熱攪拌溶解。滅菌121℃15分鐘滅菌。待溫度降低至室溫后于無菌操作臺內(nèi)加入200ml馬血清，100ml 15%酵母膏溶液及100ml解凍的10x儲存液，混合均勻后分裝至已滅菌的有蓋螺旋試管中，10ml/管。4℃保存，保存期限為1個月。