菌種保存和微生物常識

　　1、常用培養(yǎng)基的制備、滅菌與消毒

　　營養(yǎng)：從外部環(huán)境攝取其生命活動所必需的能量和物質(zhì)，滿足生長和繁殖需要的一種生理過程。是生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生命活動的起點。

　　營養(yǎng)物：具有營養(yǎng)功能的物質(zhì)。也包括光能。提供生物的結(jié)構(gòu)物質(zhì)、能量、代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)和良好的生理環(huán)境。

　　營養(yǎng)要素：碳源、氮源、能源、生長因子、無機(jī)鹽和水

　　培養(yǎng)基：人工配制、適合微生物生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的混合養(yǎng)料。要求：應(yīng)具備6大營養(yǎng)要素;物質(zhì)比例合適;必須滅菌。

　　2、選用和設(shè)計培養(yǎng)基的原則、方法及制備過程

　　原則：目的明確 、營養(yǎng)協(xié)調(diào)、經(jīng)濟(jì)節(jié)約

　　物理化學(xué)條件適宜

　　方法：生態(tài)模擬、查閱文獻(xiàn)

　　精心設(shè)計、試驗比較

　　步驟：稱量、熔化、調(diào)PH、過濾、分裝、

　　加塞、包扎、滅菌、冷卻、無菌檢查

　　培養(yǎng)基種類：

　　一、按成分的不同分

　　天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基

　　二、按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分

　　固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基

　　三、按培養(yǎng)基用途

　　基礎(chǔ)培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基 、加富培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基

　　消毒與滅菌 ：

　　消毒：消滅病原菌和有害微生物的營養(yǎng)體

　　滅菌：殺滅一切微生物的營養(yǎng)體，芽胞和孢子。

　　方法：

　　一、物理的方法：加熱、過濾、輻射

　　二、化學(xué)的方法：用化學(xué)試劑抑制或殺滅微生物。主要破壞細(xì)菌代謝機(jī)能。如重金屬離子，磺胺類藥物及抗生素等。

　　加熱法：

　　(1)干熱法：火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌。

　　1、火焰灼燒適用于接種環(huán)、接種針和金屬用具如鑷子等，試管口和瓶口，涂布用玻璃棒。

　　2、熱空氣滅菌利用高溫干燥空氣(160-170C)加熱滅菌1-2h，適用于玻璃器皿和培養(yǎng)皿等。原理加熱使蛋白質(zhì)變性，與水的含量有關(guān)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞含水量越大，凝固越快。

　　3、注意事項：

　　1)培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品不能用此法;

　　2)溫度控制在<180°;

　　3)物品不能太擠;

　　4)溫度降至70°時才開箱門。

　　(2)濕熱法 ：原理：因為濕熱中菌體吸水，蛋白質(zhì)容易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低;濕熱的蒸氣有潛熱存在。所以效果比同溫度下干熱好。

　　高壓蒸汽滅菌法：

　　1、設(shè)備：高壓滅菌鍋

　　2、時間長短根據(jù)滅菌物品的種類和數(shù)量不同有所變化。

　　3、適用于培養(yǎng)基、工作服、橡膠物品等的滅菌，也可用于玻璃器皿的滅菌。

　　4、注意事項：

　　1)冷空氣徹底排除;2)加水;3)壓力降為“0”時方可打開。

　　常壓蒸汽滅菌：對于不宜用高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基，含糖培養(yǎng)基等可采用此法。徹底滅菌則采用間歇滅菌方法。

　　煮沸滅菌法：適用注射器和解剖器皿，時間10-15min，

　　超高溫殺菌:135-150°C和2-8s對牛乳和其它液態(tài)食品。優(yōu)點 ：保持食品價值和營養(yǎng)成分。

　　過濾除菌：

　　原理：介質(zhì)在有壓力時阻隔微生物。

　　適用范圍：許多材料如血清、抗生素及糖溶液采用此法。

　　設(shè)備：蔡氏過濾器，濾膜過濾器。

　　優(yōu)缺點：不破壞培養(yǎng)基成分，只適用少量濾液。需 大量無菌空氣以及凈化工作臺。

　　注意事項：1、壓力適當(dāng);

　　2、無菌條件下進(jìn)行;

　　3、防止?jié)B透現(xiàn)象。

　　輻射滅菌：

　　原理：紫外線波長在200-300nm，具有殺菌作用，以265-266殺菌力強(qiáng)。此段波長易被細(xì)胞中核酸吸收;可產(chǎn)生臭氧和過氧化氫。殺菌效力與強(qiáng)度和時間的乘積成正比。

　　缺點：穿透力不大。距照射物<1.2m為宜。

　　應(yīng)用：無菌室，醫(yī)院。

　　注意事項：對眼睛和皮膚有刺激作用。

　　射線滅菌：r射線，穿透力強(qiáng)，適用于堆積物品的滅菌。

　　化學(xué)藥品滅菌：

　　原理：應(yīng)用化學(xué)制劑破壞細(xì)菌代謝機(jī)能。

　　殺菌劑如重金屬離子;

　　抑菌劑如磺胺類及多數(shù)抗生素。

　　注意：與藥品的濃度高低，時間長短，微生物種類以及微生物所處的環(huán)境有關(guān)。

　　常用化學(xué)殺菌劑有：乙醇、醋酸、石碳酸

　　福爾馬林、升汞、高錳酸鉀、新潔爾滅等

　　3、微生物的分離、純化及培養(yǎng)技術(shù)

　　分離與純化：從混雜的微生物群體中獲得只含某一種或某一株微生物的過程。

　　為什么要進(jìn)行純培養(yǎng)：平板上的單一菌落并不一定保證是一種菌。

　　常用的分離、純化方法：

　　單細(xì)胞挑取法 稀釋涂布平板法

　　稀釋混合平板法 平板劃線法

　　稀釋涂布平板法 ：

　　步驟：

　　1、倒平板： 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，高氏I號培養(yǎng)基，查氏培養(yǎng)基冷卻至55-60℃時，混勻后倒平板，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒4皿，高氏I號培養(yǎng)基和查氏培養(yǎng)基各倒3皿。

　　2、制備污水稀釋液：10g土樣，加入90ml無菌水中，在三角瓶中振搖20min。取0.5ml 加入盛有4.5ml無菌水的試管中，以此類推，制成不同稀釋度。

　　3、涂布：將上述每種培養(yǎng)基平板底面標(biāo)記稀釋度，然后用無菌吸管從最后三種稀釋度，即10-4、10-5和10-6的試管中吸取0.1ml對號放入平板上，用玻棒涂布。

　　4、培養(yǎng)：高氏I號和查氏倒置培養(yǎng)于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5days，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)1-2days。

　　5、挑菌落：轉(zhuǎn)至斜面，檢查是否一致，保存。

　　平板劃線法：

　　1、倒平板，標(biāo)記培養(yǎng)基名稱，編號和實驗日期。

　　2、劃線方法

　　稀釋混合平板法 ：

　　1、先加菌

　　2、倒平板時注意培養(yǎng)基溫度

　　3、混合均勻

　　4、微生物培養(yǎng)技術(shù)

　　1、斜面接種

　　2、液體培養(yǎng)基接種

　　3、穿刺接種

　　4、將已接種的斜面、半固體和液體培養(yǎng) 基放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)

　　5、將生長好的菌種用牛皮紙包好，置4℃冰箱中保存。

　　幾種常用的保藏方法：

　　1、傳代培養(yǎng)法

　　保藏的菌種通過斜面、穿刺或皰肉培養(yǎng)基(用于厭氧細(xì)菌)培養(yǎng)好后，置4C?冰箱中存放，定期進(jìn)行傳代培養(yǎng)、再存放。

　　可用膠塞代替棉塞或在斜面上覆蓋一層無菌液體石蠟來進(jìn)一步延長保存期。

　　2、載體法

　　使生長合適的微生物吸附在一定的載體上進(jìn)行干燥。

　　常用的載體有土壤、砂土、硅膠、明膠、麩皮、磁珠和濾紙片等。

　　3、懸液法

　　將細(xì)菌、酵母菌細(xì)胞懸浮在一定的溶液中保存。

　　溶液包括蒸餾水、糖溶液、磷酸緩沖液、食鹽水等。

　　4、冷凍法

　　使菌種始終存放在低溫環(huán)境下的保藏方法。包括低溫法和液氮法。

　　此法關(guān)鍵是要克服細(xì)胞的冷凍損傷。注意控制降溫速率及保護(hù)劑的使用。

　　5、真空干燥法

　　這類方法包括冷凍真空干燥法和L-干燥法。

　　冷凍真空干燥法是將要保藏的微生物樣品先經(jīng)低溫預(yù)凍，然后在低溫狀態(tài)下進(jìn)行減壓干燥。

　　L-干燥法則不需要低溫預(yù)凍樣品，只是使樣品維持在10-20C?范圍內(nèi)進(jìn)行真空干燥。

　　操作方法

　　1、斜面保藏法

　　將菌種轉(zhuǎn)接在適宜固體斜面培養(yǎng)基上，待其充分生長后，用牛皮紙將棉塞部分包扎好(棉塞換成膠塞效果更好)，置4C?冰箱中包藏。

　　保藏時間依微生物的種類而定。霉菌、放線菌及芽孢菌保存2-4個月移種一次，酵母菌間隔兩個月，普通細(xì)菌一個月，假單胞菌兩周傳代一次。

　　此法優(yōu)點是操作簡單、使用方便，缺點是保藏時間短、易被污染。

　　2、液體石蠟保藏法

　　將無菌石蠟加在已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1CM為準(zhǔn)，使菌種與空氣隔絕。

　　將試管直立，置低溫或室溫下保存。

　　此法實用且效果較好。霉菌、放線菌、芽孢菌可保藏兩年以上，酵母菌可保藏1-2年，普通細(xì)菌也可保藏1年左右。

　　3、穿刺保藏法

　　按穿刺接種方式培養(yǎng)菌種，菌種長好后用膠塞封嚴(yán)，置4℃冰箱存放。

　　4、砂土管保藏法

　　(1)河砂處理

　　取河砂若干加入鹽酸10% ，加熱煮沸30min除去有機(jī)機(jī)質(zhì)。倒去鹽酸溶液，用自來水沖洗至中性，最后一次用蒸鎦水沖洗，烘干后用40目篩子過篩，棄去粗顆粒，備用。

　　(2)土壤處理

　　取非耕作層不含腐殖質(zhì)的痩黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。烘干后碾碎，用100目篩子過篩，粗顆粒部分丟掉。

　　(3)砂土混合

　　處理妥當(dāng)?shù)暮由芭c土壤按3：1的比例摻合(或根據(jù)需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均勻后，裝入10x100mm的小試管或安瓿管中，每管分裝1g左右，塞上棉塞，進(jìn)行滅菌(通常采用間歇滅菌2--3次)，最后烘干。

　　(4)無菌檢查

　　每10支砂土管隨機(jī)抽1支，將砂土倒入肉湯培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)40h，若發(fā)現(xiàn)有微生物生長，所有砂土管則需重新滅菌，再作無菌試驗，直至證明無菌后方可使用。

　　(5)菌懸液的制備

　　取生長健壯的新鮮斜面菌種，加入2-3ml無菌水(每18x180mm 的試管斜面菌種)，用接種環(huán)輕輕將菌苔洗下，制成菌懸液。

　　(6)分裝樣品

　　每支砂土管(注明標(biāo)記后)加入0.5ml菌懸液(剛剛使砂土潤濕為宜)， 用接種針拌勻。

　　(7)干燥

　　將裝有菌懸液的砂土管放入干燥器內(nèi)，干燥器底部盛有干燥劑。用真空泵抽干水分后火焰封口(也可用橡皮塞或棉塞塞住試管口)。

　　(8)保存

　　置4℃冰箱或室溫干燥處，每隔一定的時間進(jìn)行檢測。此法多用于產(chǎn)芽孢的細(xì)菌、產(chǎn)生孢子的霉菌和放線菌。在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛、效果較好，可保存幾年時間，但對營養(yǎng)細(xì)胞效果不佳。

　　5、冷凍真空干燥法

　　(1)凍干管的準(zhǔn)備：中性硬制玻璃，烘干，滅菌。

　　(2)菌種培養(yǎng)：細(xì)菌芽孢脫落;放，霉孢子豐滿。

　　(3)保護(hù)劑的配制：配制，滅菌，檢查。

　　(4)菌懸液的制備：2-3ml保護(hù)劑。

　　(5)分裝樣品：菌懸液每管0.2ml。

　　(6)預(yù)凍：程序控溫儀降溫。

　　(7)冷凍真空干燥：-50℃下抽真空。

　　(8)取出樣品：輕敲松散即達(dá)標(biāo)。

　　(9)第二次干燥。

　　(10)熔封。

　　(11)存活性檢測：抽取一管進(jìn)行存活性檢查。

　　(12)保存：4℃保存。