3D細(xì)胞培養(yǎng)：你對你的酶標(biāo)儀了解嗎？

一直以來，傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)廣泛用于細(xì)胞生物學(xué)研究和藥物開發(fā)，為研究細(xì)胞通路提供了方便的體外模型。然而，細(xì)胞在平面上生長，這與天然環(huán)境并不相同，也導(dǎo)致細(xì)胞行為有明顯差異。形態(tài)、增殖、基因表達(dá)、代謝和活力發(fā)生顯著變化，這會影響細(xì)胞對藥物的反應(yīng)。因此，許多臨床前研究認(rèn)為2D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是不夠的，它意味著仍需要在動物模型中開展大量的實驗，而這一過程有難度，耗時又昂貴。

一些實驗室開始采用3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)， 來幫助縮小2D體外研究和動物模型之間的差距。盡管3D細(xì)胞培養(yǎng)不是最近的發(fā)明，早在1907年人們就用于培養(yǎng)青蛙神經(jīng)元，但在過去的十年中，對細(xì)胞分析的生物相關(guān)性的追求促使各種新穎的3D培養(yǎng)技術(shù)快速發(fā)展。

這些3D培養(yǎng)技術(shù)可大致分為兩類：需要支架和不需要支架。它們旨在為細(xì)胞生長、增殖和分化提供了一個更類似于體內(nèi)的環(huán)境。許多被設(shè)計成方便的微孔板形式，讓細(xì)胞培養(yǎng)的過程完全自動化，這帶來了中等通量的重復(fù)3D培養(yǎng)。不過，實驗室中現(xiàn)有的酶標(biāo)儀大多是為2D培養(yǎng)而設(shè)計的，它們是否能讓您實現(xiàn)3D細(xì)胞分析的好處，您又如何最有效地利用這些儀器呢？

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對于所有的細(xì)胞應(yīng)用而言，光學(xué)元件位于微孔板底部的酶標(biāo)儀至關(guān)重要，因為培養(yǎng)基的量及光學(xué)性質(zhì)對自上而下的測定會有明顯的影響，導(dǎo)致重復(fù)性差和數(shù)據(jù)丟失。這對3D細(xì)胞培養(yǎng)尤為重要，因為視野深度增加。在理想的情況下，儀器應(yīng)當(dāng)有一個可調(diào)節(jié)的Z軸聚焦，讓用戶優(yōu)化孔內(nèi)高度，實現(xiàn)靈敏度最大化。一些系統(tǒng)提供全自動的Z軸聚焦，通過參考孔或多個孔的預(yù)掃描來確定最佳的Z軸位置。

激發(fā)孔徑的大小也很重要；最理想的情況是，激發(fā)光源涵蓋整個培養(yǎng)物。這樣就不必在每個孔中的不同點進(jìn)行多次測定，取平均結(jié)果，而一些3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)就是專為滿足此需求而開發(fā)的。

在發(fā)射端，3D細(xì)胞培養(yǎng)也有幾個需要注意的地方�；�于支架的3D細(xì)胞培養(yǎng)方法可能會存在高的背景熒光，這是因為支架材料的自發(fā)熒光；有必要進(jìn)行一些形式的背景校正，以避免遮蓋細(xì)胞反應(yīng)的微妙變化。而大的動態(tài)范圍也很重要，因為每孔中更高濃度的細(xì)胞會很容易導(dǎo)致整個樣本出現(xiàn)大的信號變化。

對于某些應(yīng)用，可能需要測定多個分析物，因此必須確保酶標(biāo)儀的光學(xué)元件為每個分析物帶來精確的激發(fā)和發(fā)射，且濾光片組合適當(dāng)，以避免信號的交叉。

環(huán)境控制

嚴(yán)格的環(huán)境控制對于任何細(xì)胞應(yīng)用而言非常重要，即使是小的變化也往往導(dǎo)致實驗偏差或錯誤的結(jié)果。盡管大多數(shù)酶標(biāo)儀提供某種形式的溫度控制，但我們必須了解這是如何實現(xiàn)的。很多系統(tǒng)的恒溫控制不太好，隨著時間的變化會出現(xiàn)大的溫度波動，因為系統(tǒng)對溫度測量室中溫度的升高或降低反應(yīng)太慢。加熱元件的位置也會影響各孔之間的性能。不均勻的加熱會引起微孔板的溫度梯度，影響細(xì)胞生長和酶活。對于長期的研究，這還可能導(dǎo)致各孔之間的蒸發(fā)速率不同，這會顯著影響分析性能。

3D細(xì)胞培養(yǎng)的主要目標(biāo)之一是讓細(xì)胞分析帶來更好的生物相關(guān)性，而維持與體內(nèi)相似的CO2和O2分壓很關(guān)鍵，尤其是對于真核細(xì)胞。這些細(xì)胞系的增殖和存活嚴(yán)格依賴于培養(yǎng)基條件；培養(yǎng)基的pH通常是由碳酸氫鹽緩沖液來維持的，并通過空氣中CO2分壓的精確調(diào)節(jié)來穩(wěn)定緩沖液系統(tǒng)。此外，在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的缺氧環(huán)境可能對藥物吸收和代謝有顯著影響，這讓O2分壓的精確調(diào)節(jié)變得同樣重要；在研究腫瘤細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子時，這特別有用。

然而，目前市場上大部分的酶標(biāo)儀都缺乏控制CO2和O2的能力，需要將微孔板在培養(yǎng)箱和酶標(biāo)儀之間移來移去。盡管這能夠?qū)崿F(xiàn)，但并不理想。最理想的情況當(dāng)然是，酶標(biāo)儀能夠提供CO2和O2的精確調(diào)節(jié)，實現(xiàn)連續(xù)的測定。

結(jié)語

3D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)代表了細(xì)胞分析的一次真正進(jìn)步，提供了更高的生物相關(guān)性，節(jié)省了下游實驗的費用。3D培養(yǎng)的開展需要您徹底了解酶標(biāo)儀的軟件和硬件結(jié)構(gòu)，仔細(xì)檢查儀器參數(shù)與培養(yǎng)和分析的要求是否匹配。若酶標(biāo)儀能夠?qū)崿F(xiàn)分析的完全自動化，在測量室中長期連續(xù)地測定細(xì)胞反應(yīng)，那當(dāng)然是最理想的。