原代細(xì)胞的分離和制作

[2015/9/15]

　　人或動(dòng)物體內(nèi)（或胚胎組織）由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密，不利于各個(gè)細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長(zhǎng)繁殖，即使采用1mm3的組織塊，也只有少量處于周邊的細(xì)胞可能生存和生長(zhǎng)，若需獲取大量細(xì)胞，必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開(kāi)，使細(xì)胞解離出來(lái)，常采用的方法如下：

　　一、懸浮細(xì)胞的分離方法：組織材料若來(lái)自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，最簡(jiǎn)單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘，若懸液量大，可適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間，但速度不能太高，延時(shí)也不能太長(zhǎng)，以避免擠壓或機(jī)械損傷細(xì)胞，離心沉淀用無(wú)鈣、鎂PBS洗兩次，用培養(yǎng)基洗一次后，調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)，若選用懸液中某些細(xì)胞，常采用離心后的細(xì)胞分層液，因?yàn)�，�?jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。

　　二、實(shí)體組織材料的分離方法：對(duì)于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。

　　（一）機(jī)械分散法：所取材料若纖維成分很少，如腦組織，部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織細(xì)胞或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)（用九號(hào)針），使細(xì)胞通過(guò)針頭壓出，或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物壓擠（常用注射器鈍端）使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。此法分離細(xì)胞雖然簡(jiǎn)便、快速，但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差。此法僅適用于處理纖維成分少的軟組織。

　　（二）消化分離法：組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng)。

　　1、酶消化分離法：酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶，其分離方法如下：

　　（1）胰蛋白酶分散技術(shù)：胰蛋白酶（簡(jiǎn)稱胰酶）是廣泛應(yīng)用的消化劑。胰蛋白酶是一種胰臟制品，對(duì)蛋白質(zhì)有水介作用，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細(xì)胞分散開(kāi)，在常用的蛋白酶中由于產(chǎn)品的活力和純度不同，對(duì)細(xì)胞的消化能力也不同，胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的作用，取決于細(xì)胞類型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無(wú)機(jī)鹽離子、pH以及消化時(shí)間的長(zhǎng)短等。

　　 ①細(xì)胞類型：胰蛋白酶適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。而對(duì)含結(jié)締組織較豐富的組織,如乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等就無(wú)效，但若與膠原酶合用,就能增加其對(duì)組織的分離作用。

　　②酶的活力：市售的胰蛋白酶，其活力都經(jīng)過(guò)測(cè)定而有效，但配制時(shí)必須新鮮，需保存在低溫冰箱中，消化時(shí)的pH和溫度都要適宜，否則會(huì)影響活力，細(xì)胞的分散直接與酶的活力有關(guān)，最終使用活力為1：200或1：250，56℃pH8.0時(shí)活力最強(qiáng)。該酶為粉劑，保藏時(shí)要防潮，室內(nèi)溫度不宜過(guò)高，保存時(shí)間不能太長(zhǎng)，若粉劑結(jié)團(tuán)塊，說(shuō)明該部分受潮或失效。

　　③酶的濃度：胰蛋白酶一般采用的濃度為0.1%-0.25%（活力1：200或1：250），但遇到難消化的組織時(shí)，濃度可適當(dāng)提高，消化時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)。濃度高對(duì)細(xì)胞有毒性，而較低濃度的胰蛋白酶在培養(yǎng)液中可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，若培養(yǎng)液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。

　　④溫度：一般認(rèn)為胰蛋白酶在56℃時(shí)活性最強(qiáng)，但由于對(duì)細(xì)胞有損害而不能被采用，常使用的溫度為37℃，通常在37℃進(jìn)行消化比室溫作用快。

　　⑤pH：pH8~pH9是胰蛋白酶活力適宜范圍，但隨堿性的增加其活力也隨之減少，活性強(qiáng)分散快，細(xì)胞也容易被消化下來(lái)，消化分離細(xì)胞時(shí)PH只能選用7.6～8.0之間，否則對(duì)細(xì)胞有損傷。

　　⑥無(wú)機(jī)鹽離子：若用含有鈣和鎂的鹽類溶液來(lái)配制胰蛋白酶時(shí)，可以發(fā)生抑制胰蛋白的消化作用。因此在配制時(shí)應(yīng)采用無(wú)鈣鎂離子的PBS配制。

　　⑦消化時(shí)間：如果細(xì)胞消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可以損害細(xì)胞的呼吸酶，從而影響細(xì)胞的代謝，一般消化時(shí)間為20分鐘為宜，冷消化時(shí)使用低濃度消化液，于4℃也可。

　　分離方法如下：將取得的組織用Hanks液洗三次，剪成碎塊大小為4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪組織，再加入0.25%的胰蛋白酶，搖勻后放4℃，次日再用Hanks液洗滌，棄去上清，共洗2~3次，然后，加入少量營(yíng)養(yǎng)液吹打分散，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按適當(dāng)?shù)臐舛确制颗囵B(yǎng)。

　　多次提取消化法有以下三種：

　　熱消化多次提取：將剪碎的細(xì)胞塊加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分鐘，然后經(jīng)洗滌后用營(yíng)養(yǎng)液分散制成細(xì)胞懸液，按合適的濃度分瓶培養(yǎng)，然后將留下的未徹底消化的組織按上述方法操作，再消化提取細(xì)胞。

　　冷消化多次提取：方法同上，只是消化溫度為4℃。

　　先熱消化后冷消化：將組織塊先用胰蛋白酶于37℃下消化20分鐘經(jīng)洗滌后用營(yíng)養(yǎng)液分散，制成懸液，剩余未消化的小組織塊經(jīng)洗滌后用胰酶于4℃下，次日再提取細(xì)胞，分散成懸液，分瓶培養(yǎng)。

　　（2）膠原酶（Collagenase）消化法：膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來(lái)的酶，對(duì)膠原有很強(qiáng)的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用，對(duì)細(xì)胞本身影響不大，可使細(xì)胞與膠原成分脫離而不受傷害。該酶分離效果好，即使有鈣、鎂離子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制，即操作簡(jiǎn)便又可提高細(xì)胞成活率，最終濃度200u/mL或0.1～0.3mg/mL。此酶消化作用緩和，無(wú)需機(jī)械振蕩，但膠原酶價(jià)格較高，大量使用將增加實(shí)驗(yàn)成本。

　　經(jīng)過(guò)膠原酶消化后的上皮組織，由于上皮細(xì)胞對(duì)酶有耐受性，可能有一些上皮細(xì)胞團(tuán)塊尚未被完全消化開(kāi)。成小團(tuán)塊的上皮細(xì)胞比分散的單個(gè)上皮細(xì)胞更易生長(zhǎng)，因此不必要再進(jìn)一步消化處理。鑒于胰蛋白酶和膠原酶的生物學(xué)活性和在不同濃度下消化各種組織小塊所需的時(shí)間（小時(shí)）有差異，以及兩者價(jià)格不等，有人采用膠原酶與胰蛋白酶并用，同時(shí)還可加透明質(zhì)酸酶（對(duì)細(xì)胞表面糖基有作用），采用兩者的聯(lián)合消化作用，對(duì)分散大鼠和兔肝、癌組織非常有效。

　　除上述兩種最常用的消化酶外，還有鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶，近年來(lái)，還有一種從灰霉菌中提取的Pronase新酶分散細(xì)胞更佳。

　　2、非酶消化法（EDTA消化法）：EDTA是一種非酶消化物，又稱螯合劑或Versene，全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液，對(duì)一些組織，尤其是上皮組織分散效果好，該化學(xué)物質(zhì)能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物，利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離，缺點(diǎn)是細(xì)胞易裂解或貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離時(shí)呈片狀，有團(tuán)塊，常不單獨(dú)使用，但可與胰蛋白酶混合使用（1：1或2：1），不僅利于細(xì)胞脫壁又利于細(xì)胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。